07月03 【成功案例】通過轉錄組研究合浦珠母貝異種異體移植大珠母貝的免疫抑制反應
Transcriptome analysis of the immune reaction of the pearl oyster Pinctada fucata to ?xenograft from Pinctada maxima
雜志：Fish & Shell?sh Immunology
影響因子：3.148
PMID:?28606863
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- 研究背景
大珠母貝（P. maxima）通過同種異體移植的方法進行培養面臨很大的困難，而對于合浦珠母貝（P. fucata）而言，同種異體移植培養較容易實現。如果合浦珠母貝可以作為孕育受體去培養大珠母貝珍珠，將有益于大珍珠培養產業的發展。移植后的免疫抑制反應是阻礙該產業前行的一大障礙。據前期的研究統計，珠母貝通過異種異體移植的存活率約在6.3%-15.4%之間。人體器官異種異體移植的免疫反應已有相關報道；在軟體動物中，異種異體移植的免疫抑制反應也有報道；但是在珠母貝免疫反應研究中，僅有一項通過轉錄組技術對珠母貝同種異體移植免疫抑制反應的研究。
- 研究目的
此項研究希望通過轉錄組技術對合浦珠母貝異種異體移植后免疫分子變化進行探索，尋找對抗宿主珠母貝免疫抑制反應的策略。
- 材料方法
?3.1實驗材料
大珠母貝，合浦珠母貝
實驗組：
同種組：合浦珠母貝植入合浦珠母貝地幔片
異種組：合浦珠母貝植入大珠母貝地幔片
對照組：合浦珠母貝
實驗組分別取手術后不同時期的宿主珠母貝（0 h, 6 h, 12 h, 24 h, 48 h, 72 h和?96 h）血淋巴，?Control組收集宿主珠母貝的血淋巴（0h），共15個樣本，分別進行RNA提取。
?3.2測序方法和數據量
測序平臺：Illumina Hiseq?2500 platform
總計得到107.93Gb的clean reads，平均每個樣本7.1Gb的數據。
3.3分析方法
所有分析在百邁客云平臺完成（BMK Cloud?：http://www.gicpa.org/）。
主要分析：
a．數據質控 （去接頭，去低質量的序列）；
b．利用合浦珠母貝參考基因組進行組裝；
c．與數據庫比對（NR、Swiss-Prot 、GO 、COG 、KOG 、Pfam 和KEGG）注釋；
d．差異表達基因分析（GO分析、KEGG通路富集）。
4.技術路線
5.實驗結果
5.1轉錄組測序結果
分別對14個實驗組和1個對照組樣本進行轉錄組測序，測序數值如表1所示，每個樣本的Q30都在91.42%以上，GC含量在42.19%和45.38之間。
5.2?差異表達基因分類和功能注釋
分別將各個時期（0h、6h、12h、24h、48h、72h、和96h）同種異體移植組（M組）和異種異體移植組（B組）基因表達量進行比對，獲得各個時期的差異表達基因，在0h，獲得的差異表達基因最多，共2265個，其中1097個上調，1168個下調（FDR﹤0.05，log2 ratio ≥1）。
圖1.不同時期差異表達基因
將每個時期的差異表達基因進行GO分類，獲得45-49個子分類，根據GO的三大功能類別(cellular component,molecular function和biological process)分析，大多數免疫相關的基因被富集到biological process這一類。
通過KEGG通路富集分析，各個時期的差異表達基因分別富集到148（M0/BO），106（M6/B6），99（M12/B12），92（M24/B24），73（M48/B48），123（M72/B72），和96（M96/B96）個通路中。
5.3異種異體移植引起的免疫相關差異表達基因
為了鑒定這些差異表達基因參與的免疫路徑，探索異種異體移植引起的基因表達具體變化，研究人員通過GO富集將各時期的同種移植和異種移植免疫反應相關差異表達基因分成不同的功能類別（P≤0.05），在M0/B0組中，細胞循環，NADH脫氫酶活性等相關基因顯著富集，其中一些與免疫學過程相關；在M12/B12組中，有大量的氧化還原過程和調控細胞轉移的unigenes，它們可能參與血球細胞的轉移和吞噬；通過數據分析得到，48h和72h中，損傷修復是重要的term，它與免疫反應最相關；在96h，細胞凋亡是重要的term。
結合KEGG通路富集分析，在M0/B0的比對中發現，核糖體，氧化磷酸化和GPI錨等相關路徑被顯著富集。在M6/B6比對中，有9個顯著富集的通路，包括細胞凋亡、拼接體和MAPK信號通路等，且大多數通路與免疫功能相關；值得注意的是MAPK信號通路在6h、24h、72h和96h組多次出現并且顯著富集。MAPK信號通路和其他免疫相關通路富集，可能是該研究中描述同種異體移植和異種異體移植免疫反應差異的一個好起點。
圖2.不同時期差異表達基因GO富集圖
通過unigene聚類分析鑒定了不同時間點的免疫相關基因：在0h，參與氧化還原反應的基因（包括NADH脫氫酶1、細胞色素c氧化酶1等）在異種異體移植中上調；在6h，熱休克蛋白70、熱休克70kDa蛋白等在異種異體移植中比同種異種中表達量高；在12h，NADH脫氫酶和異檸檬酸脫氫酶在異種移植中高表達；
研究人員通過GOterm分析檢測到參與氧化還原反應的表達基因，在24h，絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶 pak-1在異種異體移植中大量表達；在48h，絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶和熱休克蛋白70在異種異體移植中大量表達；在72h，絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶 pak-1在異種異體移植組中表現出下調；96h，熱休克蛋白70和TNF受體關聯因子6繼續在異種異體移植中高表達，表明免疫反應依然存在。
圖3.不同時期unigene聚類熱圖
5.4移植引起的差異表達基因鑒定
將兩個實驗組分別與對照組進行比對后，再將比對后的同種異體移植與異種異體移植進行比對。獲得不同時期（ 0h/6h/12h/24h/48/72h/96h）的差異表達基因分別為518，814，807，710，689，700，832個。
圖4.兩實驗組與對照組比對韋恩圖
通過KEGG通路富集分析，河馬信號通路、內質網蛋白加工、 MAPK信號通路、核糖體等通路顯著富集。許多基因在實驗組高表達，在對照組表達量較低，細胞異常死亡蛋白1和蛋白激酶7在對照組中表達量較高，但是在實驗組中幾乎不表達，說明這些差異表達基因是由移植引起 。
6.RT-PCR驗證
從不同表達水平中隨機選擇10個與免疫相關差異表達基因進行qRT-PCR實驗，實驗結果與RNA-Seq結果基本一致，證明了本實驗中的差異基因表達譜準確可靠。
圖5.RT-PCR驗證
7.結論
綜上所述，無論在同種移植還是異種移植，免疫抑制都是重要的免疫反應。細胞凋亡、河馬信號通路、氧化還原作用、MAPK信號通路、核糖體、內質網蛋白加工、嘌呤新陳代謝、NF-kappa B 信號通路、氧化磷酸化、Ras 信號通路、泛素介導的蛋白質水解參與了移植應答反應。NADH脫氫酶、HSP70、細胞凋亡蛋白酶-7分別在氧化還原反應，MAPK信號通路和細胞凋亡途徑表現出不同的表達量?？梢酝茰y氧化還原反應很可能是移植后免疫抑制反應中的關鍵因素。這些發現有助于闡明異種異體移植免疫抑制反應的分子機制，也有益于珠母貝異種移植免疫抑制試劑的開發。
8.創新點
通過珍珠貝同種移植和異種移植差異表達基因的比較研究，尋找異種異體移植免疫抑制中的關鍵影響因素，開辟了珍珠貝異種異體移植研究的新方向。