07月03 “逆向思維”——良性病變組織NGS研究高分文章解析
習慣了正向思維不如來個反向思維；
???????????????????????????????????惡性癌組織研究多了不如研究下良性病變組織
文獻：Ye L, Zhou X, Huang F, et al. The genetic landscape of benign thyroid nodules revealed by whole exome and transcriptome sequencing[J]. Nature Communications, 2017, 8.
?研究背景：
乳頭狀甲狀腺癌（papillary thyroid carcinoma，PTC）：是最常見的甲狀腺癌，其發病率約占甲狀腺癌發病率的70-80%， 每10萬人中有5.7個人患有PTC，女性約為8.8人，男性約為2.7人，屬于低度惡性腫瘤，分化程度高，預后良好。甲狀腺癌發病的第一癥狀是在頸部的甲狀腺區出現結節，結節常為無痛性，甲狀腺結節發生率很高，這些結節中約有5%的結節可能會出現癌變。已經有諸如TCGA等研究機構對PTC的腫瘤相關變異進行了鑒定（BRAF和RAS基因突變等），但是對于良性結節的基因組特征所知甚少。良性增生性甲狀腺結節，尤其是腺瘤樣結節，尚未研究過。
新穎點/研究目的：1.甲狀腺癌組織研究的很多，良性結節的遺傳和表達景觀如何？
- 傳統認為PTC和良性結節具有獨立起源，是否可以提供基因組層面證據？
- 傳統的基因檢測技術通過檢測惡性癌組織相關突變標志提供納入標準（rule-in）輔助診斷，是否可以鑒定良性組織相關突變標志提供排除標準（rule-out）？
實驗材料：共計28例患者的經過手術獲得的127個樣本的癌組織（PTC）或結節組織、正常組織及配對的germline外周血液樣本。患者根據有無PTC癌組織分成2組，TB和SB（只有良性結節，且持續2年）。
研究結果：
1.良性腺瘤樣甲狀腺結節相比于乳頭狀甲狀腺癌具有獨特的變異
外顯子組測序（平均161X）結果顯示，相比于外周血，在正常組織、良性結節組織和乳頭狀甲狀腺癌組織中共計檢測到了528個基因中的688個體細胞突變，腫瘤組織和結節組織中體細胞突變數目（/Mb）明顯高于正常組織，但腫瘤組織和結節組織的突變特征（6種類型的堿基替換及其上下文）卻明顯不同。
經過高頻突變基因（significantly mutated genes,SMGs）分析，乳頭狀甲狀腺癌中以BRAF突變為主（80%樣本中攜帶），最主要的是BRAFV600E突變，這與TCGA的研究是一致的。而良性結節（TB和SB兩組）組織中與癌組織中完全不同，檢測到了互相排斥的ZNF148 (21.4%)、SPOP (14.3%) 和EZH1 (10.7%)。
高頻突變基因頻譜
在額外的231例良性結節中對上述三個基因中主要的體細胞突變進行了驗證，ZNF148基因突變頻率有所下降（5.4%），其他2個基因突變保持相似水平（SPOP P94R 11.2%，EZH1 Q571R 9.3%）。55例濾泡狀甲狀腺癌（follicular thyroid carcinomas，FTC）中未檢測到上述3個基因突變，表明特異存在于良性結節中。
SPOP，EZH1和ZNF148體細胞突變示意圖
利用人正常甲狀腺細胞系Nthy，構建突變體進行功能實驗發現，EZH1 Q571R突變細胞系相比于野生型細胞系，細胞增殖能力輕微增加，侵襲能力降低。EZH1體細胞突變可能是甲狀腺腫的早期刺激因素之一。
細胞增殖和侵襲實驗
對外顯子數據進行CNV分析，只在癌組織中檢測到了已知的PTC相關的22號染色體長臂arm水平拷貝數缺失，而良性結節中沒有發現重現性的CNV。轉錄組數據分析后，也沒有發現重現性或者功能性的基因融合。
TB組來自相同PTC患者配對的癌組織和良性結節間相同的突變很少
PTC癌組織-良性結節pairs間的共有突變頻率展示
PTC癌組織和良性結節的重疊突變頻率最低（0-21.4％，中位數7.7％）。 當考慮匹配的正常組織時，只有9個PTC癌組織和良性結節對顯示重疊的突變（1.7-7.4％）。共有突變少與純度沒有顯著相關性。TB組20個PTC患者的配對組織間體細胞突變變異等位基因頻率（variant allele frequency,VAF）進行相關性分析，癌組織-良性結節間的相關性最差。
配對樣本間體細胞突變VAF相關性熱圖
良性結節與PTC癌組織間具有不同的基因表達模式
對9個患者（5個TB和4個SB）的26個組織進行轉錄組測序，相比于正常甲狀腺組織共計檢測到21441個差異表達基因，只有8％的上調和3.1％的下調基因在PTC和良性結節之間重疊。
差異表達基因Venn圖
經過層次聚類分析，惡性癌組織聚類在一起，和良性結節/正常組織分開，且TB和SB的良性結節組織聚類在一起，表明二者間相似的功能。
差異表達基因層次聚類熱圖
采用3種已知的甲狀腺分化和信號傳導特征分類器均發現良性結節和PTC癌組織明顯分離。3個分類器分別為：甲狀腺分化評分（TDS，16個與甲狀腺代謝和功能相關的基因）、ERK活性評分（EAS，用于MEK / ERK活性測定的52個基因）和BRAF-RAS突變特征相關的71個基因集。
甲狀腺分化評分TDS和ERK活性評分熱圖
良性結節和PTC癌組織獨立進化
對20名患者構建了系統發育樹，以說明PTCs、良性結節和正常甲狀腺組織之間的進化關系。大多數患者（15/20例）在良性結節和PTC之間早期即處于不同分支進化，特別是在正常甲狀腺組織納入分析時，表明PTC癌組織與良性結節間早期分離和不同的進化模式。
基于突變的系統發育樹
研究結論
本研究提供強有力的證據表明良性甲狀腺結節具有與PTC癌組織不同的遺傳和轉錄組景觀，證實了良性結節發育與PTC腫瘤形成不同。 良性甲狀腺結節不同于癌前病變，例如存在復發性BRAF突變的黑素細胞痣或具有惡性轉化風險的良性病變。作者認為，將SPOP，ZNF148和EZH1作為良性結節相關基因的納入，通過提供“排除”信息，有可能提高基于DNA的突變檢測的診斷效能。在目前的甲狀腺分子診斷中添加良性相關突變標志，從而提供“排除”信息，可能會增加其診斷功效。
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