07月19 【成功案例】雞中腹部前脂肪細胞分化過程中lncRNA和mRNA表達的全基因組分析
Genome-Wide Analysis of lncRNA and mRNA Expression During Differentiation of Abdominal Preadipocytes in the Chicken
PMID:?28108554
雜志：G3 (Bethesda)
影響因子：2.861
研究背景：腹部脂肪是肉雞的重要胴體性狀。選育過程中對雞快速生長率的過分強調導致了過多的脂肪堆積，過量的脂肪沉積導致飼料轉化率、胴體產量、產蛋率、受精率和孵化率降低。因此，腹部脂肪含量較低成為肉雞的主要育種目標。脂肪細胞生成是受多種轉錄事件調節的一個復雜過程，近期的一些研究通過全基因組范圍內的mRNA?(Ji et al.?2012；Regassa and Kim 2015)和microRNA?(Wang et al.?2015)分析，探索了雞脂肪生成的相關調節機制。但是目前對脂肪生成的調節機制知之甚少。此外，長鏈非編碼RNA（lncRNA）調節脂肪形成和其他與代謝組織發育和功能相關的過程，但是雞體內前脂肪細胞分化期間lncRNAs的功能和特征尚不清楚。
材料方法：
1.實驗材料：
取14日齡京海黃雞，無菌條件下分離4g腹部脂肪組織。剪碎組織、膠原酶I消化并分離基質血管組分后，利用DMEM/F12培養基（含10%胎牛血清），在35℃和5% CO2的條件下培養至90%匯合度。分別誘導分化0、48、96和144 小時后取樣進行RNA-seq，每個時間點做三個生物學重復。
2.測序方法及數據量：
RNA-seq，Illumina XTen.?從12個樣本總共獲得了1,300,074,528 clean reads?(195.02 Gb)。
技術路線：
實驗結果：
- 測序結果和質量控制
分離培養腹部前脂肪細胞，誘導分化48小時、96小時和144個小時后取樣進行RNA-seq，未誘導分化的細胞（0小時）作為對照。對12個樣本的文庫進行測序得到1,300,074,582 (195.02 Gb)?clean reads。每個樣本的Q30都在92.81%以上，平均GC含量為52.51%，12個樣本的比對率在79.40和84.30%之間。
- 前脂肪細胞lncRNA及其功能預測
經篩選獲得了27,023個新的lncRNA?；趌ncRNA順式作用功能鑒定了4915個靶基因。進一步通過GO分析發現總共有1746、1544和2174個基因分別被富集到生物過程、細胞組成和分子功能三個GO條目內。KEGG富集分析顯示917個基因被顯著富集到包括Wnt、MAPK和血管平滑肌收縮通路中。
- 腹部前脂肪細胞分化相關的差異表達lncRNAs和mRNAs分析及功能注釋
將分化0、2、4、6天的前脂肪細胞樣本進行兩兩比較(A0?vs. A2；A0 vs. A4；A0 vs. A6；A2 vs. A4；A2 vs. A6和A4 vs. A6)得到了1,336個差異表達lncRNA和1,759個差異表達mRNA，在各個階段差異表達的基因(Differential expression, DEGs)的數量隨著細胞分化而下降(Figure 4)。3095個DEGs的GO分析結果顯示生物過程分類的前三個富集條目是細胞代謝過程、細胞過程和電子傳遞鏈。在分子功能分類中前三個富集條目是轉移酶活性、蛋白結合和核苷結合。在細胞組分類別中前三個富集條目是細胞質部分、細胞質和胞外區。通路分析結果顯示丙酸代謝、脂肪酸代謝，內質網蛋白質加工和纈氨酸、亮氨酸、異亮氨酸降解途徑被顯著富集。此外，通過k-means均值聚類，3,095個差異基因被聚成8個表達模式。其中，K2這一簇基因中在前脂肪細胞分化中起著重要作用。
Figure 4 Venn diagram of differentially expressed genes (DEGs) at?different stages.
- 共表達網絡和模塊構建
對3095個DEGs的共表達網絡分析鑒定出10個關聯模塊（figure 6B）。隨后對這些模塊進行了基于特征向量基因的聚類分析，10個模塊被分為四組：第一是藍綠色模塊；第二：紅色，棕色，粉紅色的模塊；第三模塊，包括紫色和紅色；第四組為藍色，黑色，綠色，黃色的模塊（figure 6C）。屬于同一組的模塊可能具有相同或相似的功能和調節機制。
Figure 6 Visualization of construction of the coexpression network.
- 時期特異性模塊的鑒定和可視化
使用加權基因共表達網絡分析（WGCNA），鑒定了與A0（第0天），A2（第2天）和A6（第6天）階段相關的6個階段特異性模塊，這些模塊的表達模式可能在脂肪細胞分化中發揮重要作用（figure 6B, D）。
- 核心和高度相關基因的鑒定
在黑色、藍色、綠色和黃色四個高度相關的模塊中鑒定了五個共同的基因。這表明xloc_068731，xloc_022661，染色質解旋酶DNA結合蛋白6（CHD6），幼蟲巨大致死基因同源物1（llgl1），以及Neuralized?E3泛素蛋白連接酶1b（neurl1b）可能在A2分化階段扮演重要的角色。在棕色模塊，Kelch家族成員38（klhl38）和xloc_045161為高度相關的mRNA與lncRNA，表明其潛在的脂肪細胞分化調控作用在A6階段。肌動蛋白相關蛋白6同源物（actr6）和xloc_070302是A0時期與分化調節相關的重要調節因子（Figure 8）。
Figure 8 Visualization of connections of genes in various modules.
- 階段特異性模塊基因的GO和通路分析
GO分析顯示，RNA代謝過程、調節定位、及細胞代謝過程均在A0期富集；前體代謝物質和能量產生，電子傳遞鏈，有機物氧化的能量產生在A2階段高度富集；囊胚發育和細胞過程均在A6階段富集。在通路分析中， A0和A6階段沒有鑒定出顯著的通路。A0階段的前三個通路是卵母細胞減數分裂，溶酶體，和半乳糖代謝；而不飽和脂肪酸合成，細胞凋亡，和丙酸代謝是A6階段的前三個通路。A2階段氧化磷酸化被顯著富集。
- RT-PCR驗證差異表達基因
選取用于RNA-seq的樣本中的核心和高度相關基因XLOC_045161, XLOC_070302, XLOC_068731, XLOC_022661,ACTR6, CHD6, LLGL1和NEURL1B進行RT-PCR驗證，實驗結果與RNA-Seq結果一致（Figure 9）。
Figure 9 Validation of highly connected genes using RT-qPCR. *P ＜0.05, **P＜0.01.
結論：經RNA-seq和篩選在雞前脂肪細胞中獲得了27,023個新的lncRNA。不同分化階段的前脂肪細胞兩兩比較總計鑒定出3095個DEGs，它們參與甘油脂代謝、mTOR、PPAR和MAPK信號通路。通過RT-PCR鑒定和驗證了8個階段特異性模塊中的高度相關基因，實驗結果與RNA-Seq結果一致。
創新點：
這項研究第一次分析了雞腹部脂肪前體細胞分化過程中lncRNA和mRNA的表達。首次報道了一些與前脂肪細胞分化相關的通路，包括丙酸代謝，脂肪酸代謝和氧化磷酸化途徑，為進一步研究雞的lncRNA提供了寶貴的資源，有利于更好的了解雞的前脂肪細胞分化。