07月19 【成功案例】通過轉錄組分析合浦珠母貝同種異體移植血細胞中免疫相關差異表達基因的鑒定
Differentially expressed immune-related genes in hemocytes of the pearl oyster Pinctada fucata against allograft identified by transcriptome analysis
雜志：Fish & Shell?sh Immunology
影響因子：3.148
PMID:?28126621
研究背景：合浦珠母貝是在中國普遍養殖的海洋珍珠貝，占海洋珍珠產業90%以上的比例。為了培養珍珠，需要將供體珍珠牡蠣的地幔片用細胞核移植到受體中，但是移植后的免疫抑制反應會使成功率降低。加強了解宿主牡蠣對移植體的免疫反應有利于提高珍珠培養技術的效率。然而，當前的研究中關于珍珠貝對同種異體移植的免疫抑制報道卻很少。本文擬通過對移植的合浦珠母血細胞轉錄組動態變化進行研究，獲得移植反應過程相關基因。
研究材料：?
生長1.5年的健康合浦珠母貝（P. fucata）
將和浦珠母貝進行同種地幔片移植手術，分別收集手術后0h和48h血淋巴，每個時期選取6-7只牡蠣的樣本進行混合，分別提取兩個樣本的total RNA。
研究方法：在本研究中，對同種異體移植后0小時和48小時的珍珠貝的血細胞免疫反應進行了轉錄組分析。與合浦珠母貝的參考基因組進行了比對，為了鑒定所有與免疫相關的差異表達基因，本研究進行了GO注釋和KEGG通路分析。最后，隨機篩選免疫相關差異表達基因進行qRT-PCR驗證，以確保研究的準確性。
測序平臺：Illumina Hiseq 2500 platform
測序數據量：測序得到92.5M的clean reads
技術路線：
結果
結果
1.測序結果
兩個樣本Raw reads經過去接頭和去低質量的reads后分別得到6.1Gb（0h）和6.2Gb（48h）的數據量。且每個樣本的Q30值都大于92%，GC含量分別是44.73%（0h）和42.19%（48h），與合浦珠母貝參考基因組比對率分別是58.95%（0h）和60.27%（48h），如表1所示。
表1.轉錄組測序數據統計分析
2.基因注釋結果
與合浦珠母貝參考基因組比對，共獲得1912個新基因，通過與NR/Swiss-Prot/ GO/ COG和KEGG數據庫比對，其中1579個基因找到注釋信息，另外333個基因沒有在數據庫中找到注釋信息，如表2所示
表2.新基因注釋信息統計
3.兩組之間差異表達分析結果
比對0h和48h基因表達量，共獲得798個差異表達基因（其中410個上調基因，388個下調基因）。在這些差異表達基因中其中有226個與編碼熱休克蛋白家族的基因在0h高表達，其中314個與編碼絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶和EF-hand 鈣離子結合蛋白的相關基因在48h高表達，這些基因都與免疫防護有關。
圖1.0h/48h每個基因表達水平火上圖
4.差異表達基因功能注釋結果
為了進一步研究這些差異表達基因的生物學價值，對這798個差異表達基因按照功能進行GO富集分析，共產生45個GO terms。所有的基因都歸到cellular?component（17個terms），molecular function（11個terms）和biological processes（17個terms）三個功能類別，其中與免疫相關的差異表達基因主要富集在“biological process”一類，且這一類別中有9個差異表達基因富集在免疫系統過程子分類，有67個差異表達基因富集在刺激反應子分類。
圖2.差異表達基因GO分類
5.免疫反應相關差異表達基因的鑒定結果
為了在這些差異表達基因中更進一步的挖掘免疫相關基因，研究人員將免疫反應相關差異表達基因按照不同功能進行分類，獲得64個GO terms，其中包含51個差異表達基因，有刺激反應（8個基因）、抗菌體液反應（5個基因）、對壓力的響應（8個基因）。其他的GO terms主要與這些子分類相關：受體介導的胞吞、真菌反應、饑餓反應以及損傷修復。鑒定了一些參與細胞凋亡和死亡的基因，包含金屬蛋白酶-19基質、絲氨酸/蘇氨酸激酶、Kr-h1、酪氨酸蛋白激酶Abl、和ATP結合轉運蛋白。另外，有24個差異表達基因屬于刺激、壓力和溫性反應的GO類別。這些基因跟移植免疫反應相關（其中6個上調，18個下調），包括TLR 和HSP。
研究人員將以上獲得的所有的差異表達基因比對到KEGG數據庫去尋找與免疫反應相關的基因。在798個差異表達基因中，有122個基因對應到64個KEGG通路。其中，19個免疫相關基因對應到16個通路，包括內吞作用（5個）、NOD-like受體信號通路（1個）、泛素介導蛋白質水解（4個）和其他路徑。研究人員主要關注抵御病原體入侵相關的toll-like受體信號通路和溶酶體。這一路徑有四個主要的基因家族，分別有TLRs、?IRFs、Ils和?TNFs。共鑒定了1個與TLR信號通路相關的unigene，2個與溶酶體相關的unigene 。
圖3.Unigene的KEGG通路分布圖
該研究通過基因注釋、聚類分析和通路分析的方法，最終鑒定了72個典型的免疫基因（其中25個上調基因，47個下調基因）。隨后，研究人員將這些免疫相關差異表達基因按照不同時期進行分層聚類分析，在0h和48h兩個時期的免疫相關差異表達基因有明顯不同，說明移植前后牡蠣中免疫相關變化明顯。
圖4.?分層聚類分析
6.qRT-PCR驗證
研究者隨機對其中18個免疫相關的差異表達基因進行qRT-PCR實驗。結果顯示用qRT-PCR檢測到的倍性變化與RNA-Seq的表達模式相比，結果基本一致，且RNA-Seq檢測更敏感。
圖4.qRT-PCR驗證
研究結論
該轉錄組研究共發現了1912個新基因，移植和非移植組比對后共有798個差異表達基因，通過GO富集和KEGG通路分析等方式最終鑒定出了72個典型的免疫相關基因，包括TLRs、細胞因子、HSPs、細胞凋亡和抗氧化劑等。另外，通過qRT-PCR對其中18個免疫相關的差異表達基因進行驗證，實驗結果與RNA-Seq的結果基本一致表明該實驗結果準確可信。
創新點
首次通過合浦珠母貝轉錄組測序研究尋找到與同種異體移植免疫相關的基因，為進一步分析合浦珠母貝同種異體移植的免疫抑制提供了依據，為同種異體移植牡蠣存活率的提高提供了有價值的信息。