07月19 【成功案例】比較轉錄組分析和形態學對杏品種（Prunus armeniaca L.）的內果皮發育缺陷的研究
研究背景：
杏（P.armeniaca）屬于薔薇科中常見的一種核果，全世界范圍內分布廣泛，具有較高的營養價值，富含膳食纖維、有機酸、維生素C、胡蘿卜素、微量元素等。 木質化的內果皮（endocarp）在包括杏在內的許多具有較高經濟價值的核果（drupe fruits）種子發育過程中發揮著非常重要的作用，為種子提供了安全的發育環境，避免了直接暴露于各類害蟲與病原菌。 內果皮木質化是核果成熟的一個重要標志，木質化的過程本質上是植物次生細胞壁形成與木質素積累的過程，在以往其他核果中的研究發現，一些與植物生長發育相關的重要轉錄因子，比如MYB、NAC、MADs-box，在核果內果皮的發育調控網絡中扮演著重要的角色。 本研究以兩種不同內果皮表型的兩種杏作為實驗材料，借助高通量測序來揭示杏內果皮發育背后的分子調控機制。
材料與方法：
測序材料：
LE品種杏 內果皮薄、柔軟、韌性高 JG品種杏 內果皮厚、堅硬、韌性低 取樣部位： 去核果實 測序平臺： Illumina HiSeq? 2500 PE125測序
技術路線：
結果–LE、JG品種杏內果皮表型觀察比較
a）如圖2所示，兩種品種杏的果實具有相似的發育模式，a1、b1、c1是以開花后時間（DAFB)為橫坐標，分別以果實重量、果實長度、果實寬度為縱坐標做圖，兩種杏的果實均呈現出了“雙S曲線”生長模式，圖a2、b2、c2是分別對a1、b1、c1一階導數作圖，兩種果實同樣也表現出相似的趨勢。 根據生長曲線，研究者將果實的發育劃分為4個時期：第一次指數生長期（before 30DAFB）、緩慢生長期（30-49DAFB）、第二次指數生長期（49-83DAFB）、成熟期（after 83DAFB）。
b）圖3展示了兩種品種杏的內果皮在果實發育的不同階段各項指標的比較，包括內果皮木質素含量（圖3d）、內果皮厚度（圖3e）、內果皮界面面積（圖3c）、內果皮木質素積累直觀觀察（圖3b）、內果皮顯微鏡直觀觀察結果（圖3a）。 圖3a顯示，LE品種與JG品種的內果皮在15DAFB之前形態上基本無差異，15DAFB之后，LE品種的內果皮開始出現破裂缺失，隨著發育階段往后推移，破裂程度越來越大。 圖3e顯示，LE品種與JG品種的內果皮在30DAFB之前厚度上并無差異，之后在厚度上，兩種品種出現顯著差異。 圖3d顯示，LE品種與JG品種的內果皮中木質素含量也在24DAFB之后出現顯著差異。
綜合以上表型觀察結果得出，LE品種與JG品種的內果皮發育過程以及內果皮木質素含量存在顯著差異。
結果–mRNA測序與轉錄本組裝
a）測序取樣部位 ： 去核后的果實，每個品種兩個生物學重復 測序取樣時間點 ： 根據上一部分的表型觀察結果，LE品種內果核在15DAFB時出現裂縫，在24DAFB時，裂縫程度開始快速增大，因此，該mRNA測序項目選擇了15DAFB和24DAFB兩個時間點樣本 b）轉錄本組裝：測序共得到~20Gbase clean data，使用Trinity軟件組裝得到63,170條unigene，unigene N50大小1689bp，詳細組裝結果參見表1。
結果–unigene功能注釋
a）基于blast比對，63,170條unigene中有25,356可比對到日本杏（Japanese apricot）與桃（peach）基因組數據庫。 b）使用BLASTx（e-value閾值設為10e-5）將上述25,356條unigene比對到NR, Swiss-Port, GO, COG, KOG ，kegg數據庫以進行功能注釋，每條unigene均有多條注釋，詳細的注釋結果統計信息請參見表3. c）GO數據庫注釋過程中，16,506條unigene被注釋到，其中， ‘metabolic process’ (8408 genes, 50.93%)是被注釋到最多的GO 條目；KEGG數據庫注釋過程中，4830條unigene被注釋到了118個代謝通路。大部分的unigene被注釋到了‘carbohydrate metabolism’ (905 genes), ‘translation’ (596 genes), ‘amino acid metabolism’ (581 genes), or ‘folding, sorting and degradation’ (471 genes)等代謝通路。
結果–差異表達基因檢測
使用DESeq進行了差異表達基因檢測，差異表達基因篩選閾值為：FDR<0.01，FC > 2 。15DAFB時間點上，兩個品種間檢測到差異表達基因2887個，24DAFB時間點上，兩個品種間檢測到差異表達基因886個，具體上下調、共有特有情況請參見圖5.
結果–差異表達基因功能分析
a）LE品種內果皮破裂與發育不全是一個非常復雜的表型，與眾多的代謝通路相關，但類苯基丙烷相關通路是眾多代謝通路中已經證實的非常重要的一個。該項目中對兩個品種在兩個時間點的差異表達基因的KEGG富集分析結果也證實了上述事實，所以差異基因顯著富集于類苯基丙烷代謝、合成等通路。類苯基丙烷相關通路相關差異表達基因見列表4與圖6。
b）一些轉錄因子也被報道與內果皮發育相關，包括SHP 、 STK、ALC、IND、FUL、RPL、NST1、NST3以及一些MYB家族轉錄因子。該項目中，SHP, FUL, MYB32 ,STK, MYB46–1, MYB46–2, ?NST1 也包含在兩個品種間的差異表達基因列表中，也發現了上述部分基因差異表達方向與預期不符。
結果–RT-PCR驗證
挑取18個表型相關基因，對測序分析得到的差異表達結果進行了驗證，結果顯示，兩種技術得到的基因定量結果間的pearson相關系數可達到0.9188, P value 小于 0.0001，說明測序分析結果具有較高的可靠性，RT-PCR定量結果參見圖8。
結果–共表達分析
a）文章最后，使用K-means聚類對之前得到的差異表達基因進行了共表達分析，分析結果顯示：基于表達趨勢，所有差異基因可劃分為7個cluster，每個cluster內部的基因具有相似的表達趨勢，也就可能在細胞內行駛著相似的功能，聚類結果見圖7。 b）之前分析得到的內果皮發育相關基因大多分布在cluster1或者cluster6，cluster1中的基因在LE品種中高表達，JG品種低表達，cluster6與cluster1相反。
結論：
1）LE品種杏的內果皮裂縫出現于15 DAFB（開花后15天），裂縫面積也會在之后會越來越大；
2）成熟的LE品種杏的內果皮的厚度及木質素含量分別僅為內果皮正常發育品種JG的60.39%、63.25%；
3）已有研究表明與內果皮發育相關的一些轉錄因子及類苯基丙烷合成代謝相關基因，也包含于該項目得到的差異表達基因列表中；
4）一些轉錄因子尤其是NST1可能參與調控了類苯基丙烷相關代謝通路；