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09月01 【成功案例】云平臺助力爪蟾卵母細胞m6A修飾mRNA功能研究

分子生物學的中心法則中，遺傳信息從DNA傳遞給RNA再流向蛋白質，此過程中RNA不僅發揮遺傳信息傳遞的作用，還負責調控各種生物學過程。早在40年前研究者就發現mRNA存在類似于基因組DNA和組蛋白上可逆的表觀遺傳修飾（其中N6-methyladenosine m6A是最常見的一種轉錄后修飾，介導了超過80%的RNA堿基甲基化），但當時并不清楚RNA這種修飾的具體功能，隨著近期研究的深入逐漸揭開了mRNA甲基化的神秘面紗，它可以參與調控基因表達，并進一步調節細胞的分化和發育。對mRNA甲基化相關的轉錄組測序數據的分析當然離不開便捷、可靠的數據深度挖掘工具啦！近期百邁客云平臺Blast小工具助力孫青原老師關于m6A參與調節爪蟾卵母細胞減數分裂成熟和胚胎發育的文章發表于“Journal of biological chemistry”雜志。接下來，小編跟大家分享這篇文章。

N6-methyladenosine seqencing highlights the involvement of mRNA methylation in oocyte meiotic maturation and embryo development by regulating translation in Xenopus laevis

N6-甲基腺苷測序揭示mRNA甲基化通過調節非洲爪蟾的翻譯水平參與卵母細胞減數分裂成熟和胚胎發育

PMID: 27613873

雜志：Journal of biological chemistry (JBC)

影響因子：4.12

材料方法

1.實驗材料：

GV期和MII期爪蟾卵母細胞。

2.測序方法：

提取GV期和MII期爪蟾卵母細胞總RNA后分別進行m6A-seq測序。

技術路線

實驗結果

1. GV期和MII期爪蟾卵母細胞的m6A-seq

對GV期和MII期爪蟾卵母細胞的m6A修飾mRNAs進行分離和測序分析后與X. laevis轉錄組比對，鑒定了4207條甲基化修飾的mRNAs（GV期4128條；MII期3820條）。根據m6A峰的高度，作者把這些mRNAs分為三類：高m6A mRNAs、中m6A mRNAs和低m6A mRNAs。通過這些結果發現從GV期到MII期有1674個mRNAs保持甲基化修飾水平，此外有2400條mRNAs的m6A水平下降、133條mRNAs的m6A水平升高(Figure 1A)。

利用m6A峰值對應序列，作者預測了爪蟾中保守的m6A基序。與人和小鼠中相似，爪蟾中mRNA甲基化也發生在GGACU基序(Figure 1B)。研究還發現m6A峰主要分布在編碼DNA序列（CDS）的下游位置的CDS末端位點附近(Figure 1C)。

?Figure 1. Summary of the m6A modified mRNAs in X. laevis oocytes.

2. 爪蟾中甲基化mRNAs相關通路的基因集富集分析

為了研究RNA甲基化是否參與卵母細胞成熟和胚胎發育，作者利用DAVID工具對m6A修飾mRNA進行了KEGG通路分析。結果高或者中等甲基化的mRNAs主要富集在ErbB、孕激素介導的卵母細胞成熟和細胞周期等通路中。但是，低甲基化的mRNAs主要被富集在RNA降解、DNA復制、核糖體、剪接體、磷酸戊糖途徑和糖酵解途徑相關通路中。

為了進一步評估這些m6A修飾在非洲爪蟾卵母細胞的生物學功能，作者利用biocloud平臺的BLAST工具對爪蟾mRNAs進行了注釋(www.gicpa.org)。GO注釋的結果顯示，卵母細胞m6A甲基化mRNAs主要與生物學過程有關，如：轉錄、蛋白磷酸化和細胞分裂。

3. mRNAs甲基化與蛋白翻譯間的關系

為了探索mRNAs甲基化是否與翻譯有關，作者把mRNA甲基化數據與Smits等人已發表的轉錄組和蛋白組數據進行了整合。通過BLAST分析，在RNA/蛋白數據中找到了723個m6A修飾mRNAs的信息。GV期或者MII期卵母細胞中高m6A峰的RNA水平（log10 RNA RPKM值）比總RNA高（在卵或者胚胎中），但是蛋白水平（log10 protein amount / fmol）比總蛋白水平低（Figure 2）。與高度甲基化的mRNAs相比，低甲基化RNAs顯示出非常高的表達水平（Figure 3）。這些結果說明在卵母細胞或早期胚胎中，m6A修飾可能與mRNA翻譯有關。

Figure 2. Scatter plot of the m6A modified mRNAs in the transcriptome/proteome data.

Figure 3. Box plot of the RNA levels and protein levels of m6A modified mRNAs.

為了分析mRNA甲基化的位置（5UTR, CDS和3UTR）與翻譯的關系，作者提取了GV期卵母細胞5UTR、5’末端CDS、3’末端CDS或者3UTR位置高度甲基化的mRNA信息（Figure 4）。結果顯示5CDSs或3CDSs甲基化的mRNAs顯示出較低的蛋白表達水平。此外，3UTR甲基化的mRNAs顯示出較高的蛋白表達水平。這些數據說明CDS區域RNA甲基化可能抑制mRNA翻譯。

Figure 4. The RNA levels and protein levels of hypermethylated mRNAs in GV oocytes.

結論：在爪蟾GV期和MII期的卵母細胞中鑒定了4207個甲基化的mRNA。整合mRNA甲基化數據、轉錄組數據和蛋白組數據后發現，盡管RNA水平沒有顯著差異，高度甲基化的mRNAs與低甲基化的mRNAs相比顯示較低的蛋白表達水平。研究還發現低甲基化的mRNAs主要富集在細胞周期和翻譯信號通路中，而高甲基化水平的mRNAs主要與蛋白磷酸化有關。本文結果表明卵母細胞減數分裂成熟與早期胚胎發育時期的mRNA甲基化可以調節翻譯和細胞分裂。