09月01 【成功案例】小RNA和降解組聯合測序揭示microRNA調節茶葉(Camellia sinensis)中兒茶素生物合成
小RNA和降解組聯合測序揭示microRNA調節茶葉(Camellia sinensis)中兒茶素生物合成
Combined small RNA and degradome?sequencing reveals complex microRNA?regulation of catechin biosynthesis in tea?(Camellia sinensis)
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雜志：PLOS ONE
影響因子：2.806
PMID:?28225779
研究背景
MicroRNAs是一種內源性非編碼小RNA，在動植物轉錄后調控及其他生物學過程中有至關重要的作用?；趬A基互補配對機制，miRNAs主要通過直接切割目標mRNA和抑制目標基因轉錄這兩種方式調節目標基因的表達。前期研究表明，miRNA參與多種植物的生長和發育過程，如：根、葉、花的形態發生，信號轉導，激素反應和營養代謝等。植物miRNAs主要通過克隆、生物信息預測、高通量測序和Northern 雜交的方法來檢測。最常用的技術是高通量測序，不僅經濟實惠，而且在低豐度的情況下可以更簡單、快速獲得大量miRNAs。植物中miRNA主要是通過切割目標基因或者抑制目標基因的表達進行調控，所以目標基因的確定對miRNA功能的分析至關重要。miRNAs目標基因的預測可以通過生物信息的方法，目標基因的鑒定主要通過降解組測序和5’-RLM-RACE方法（RNA連接酶介導的5’cDNA末端的快速擴增），這兩種方式還能鑒定miRNA目標基因切割位點，有助于miRNA功能分析。
茶樹（Camellia sinensis），富含兒茶素，是風靡全球的非酒精飲料之一。兒茶素是茶葉中重要的組成部分，包括脂型兒茶素（如：ECG和EGCG）和非脂型兒茶素（如：EC和EGC）。EGCG是茶葉中含量最豐富的兒茶素并且具有較強的抗癌效果，可以制約癌細胞的生長，抑制雄激素受體的功能并調控癌細胞的生存，血管的生成和移動?；谒麄兊姆肿訕嫵?，兒茶素可以分為簡單兒茶素和脂型兒茶素。在兒茶素的合成過程中有許多酶的參與，如查耳酮合酶（CHS），查爾酮異構酶（CHI），黃烷酮醇4-還原酶（DFR），花青素合酶（ANS），花青素還原酶（ANR）和類黃酮3,5羥基化酶（F3’5’H）。MiRNA被鑒定為轉錄和轉錄后水平基因表達的重要調節因子，并且裂解目標mRNA是植物中基因表達的主要調控方式。
在茶樹中，雖然通過高通量測序和芯片技術發現了許多保守的以及新的miRNAs，但是miRNAs直接調控兒茶素生物合成還沒有明確的定義。此項研究中，研究人員通過高通量測序鑒定茶葉中保守的以及新的miRNAs，再通過5’-RLM-RACE方法分析潛在的目標miRNAs。通過表達模式分析進一步篩選兒茶素積累過程中潛在的miRNAs。結合5’-RLM-RACE實驗和表達模式分析，研究人員發現了一些新的調節兒茶素生物合成途徑中基因切割的調控因子。
材料和方法
實驗材料
茶樹1005，取葉片（包括芽，第一葉，第二葉，第三葉，第四葉，第五葉，成熟葉），進行混合，提取總RNA。
茶樹1005，取葉片（包括第一葉，第三葉，成熟葉），進行qRT-PCR表達分析和兒茶素含量測定。
測序平臺：Illumina?HiSeq 2500?（Biomarker Technology Co.）
技術路線
實驗結果
1.茶葉中miRNA的初步分析
從提取的總RNA中構建smallRNA文庫，測序質控后得到19，567，691條clean reads，與數據庫比對發現有18.83%的rRNA，1.23%的tRNA，0.01%的small nuclear RNA，0.07%的重復序列，其中79.85%的序列沒有功能注釋，可以將這些沒有功能注釋的序列用來做下一步的miRNA的預測和鑒定。根據smallRNA的測序長度分布圖可以得出，miRNA的長的主要分布在20-25nt之間，豐度最高的是24nt（47.89%）。這個長度分布和其他栽培茶以及其他植物報道的結果非常相似。
2.茶葉中保守miRNAs的鑒定
將沒有功能注釋的clean reads與miRBase（植物已知保守miRNA數據庫）進行比對，共獲得69個保守的miRNAs，分別屬于62個家族。根據長度分布發現，這些保守的miRNAs的長度主要集中在18-25nt之間，長度主要集中在24nt（46.385），其次是21nt。
對高通量測序的miRNA片段進行分析，鑒定的保守miRNA中，read values低于1000的占91.3%的比例，其中read values低于10的占56.52%的比例。研究人員還發現了一些高表達(read values大于1000)的miRNA家族，如miR165a和miR396a。另外，在不同家族中的miRNAs表達量差異較大，并且在同一家族中各miRNAs之間的表達量也有較大差異。這些數據表明，不同家族miRNA的表達模式不同，意味著不同的miRNAs在茶樹生長發育過程中的作用不一樣。
3.茶葉中新miRNAs的鑒定
通過miRDeep2和Mfold軟件分析，共鑒定出47個新的miRNAs，進一步對這些新miRNA進行片段長度和表達量分析。新miRNA跟保守miRNA長度分布相似，主要集中在18-25nt之間，最集中的長度是24nt和21nt。另外，新miRNA的表達量比保守miRNA的低，新miRNA中表達量最高的只有4517個read values。
研究人員將這些新的miRNA與其他植物中已知的miRNA進行比對，揭示了許多同系物。除了三個miRNA歸為同一個家族外，絕大多數的miRNA可以被分為獨立的家族。研究者還對新miRNA的前體進行了分析，發現他們都有一個發卡環結構，長度在84-114bp。
4.GO功能富集和KEGG通路分析目標miRNA
為了研究茶樹miRNA的功能，研究人員運用TargetFinder軟件和轉錄序列對上述miRNA進行目標基因預測。結果顯示，其中97個miRNA對644個目標基因有調控作用。再將644個目標基因進行GO和KEGG通路富集分析：GO富集分析發現這些目標基因主要富集在細胞、細胞器、細胞膜、連接活性、轉運活性、新陳代謝和細胞進程等功能條目；KEGG通路富集發現366個目標基因參與36個代謝網絡相關，主要參與糖酵解、檸檬酸循環、氨基酸代謝、光合作用、脂肪酸代謝、嘌呤嘧啶代謝、氧化磷酸化、植物病原體相互作用、初級代謝產物和次級代謝產物過程。
- miRNA靶向基因降解組測序和功能分析
為了進一步預測和鑒定miRNA靶向基因，研究團隊構建了降解組文庫并進行深度測序，結合轉錄組數據和上述獲得的miRNAs，通過TargetFinder軟件預測到216個靶向基因被97個miRNAs調控。在這些靶向基因中，降解組測序鑒定了26個基因的26個切割位點，被16個miRNA家族的19個miRNAs進行轉錄后調控，如表1。
表1.通過降解組測序鑒定茶樹1005中miRNA靶向基因
- 基于5’-RLM-RACE技術對目標斷裂位點的驗證
研究人員采用5’-RLM-RACE的方法，對其中5個有注釋的miRNA（來自降解組測序）切割位點進行驗證。結果顯示，目標基因comp152929被csn-miR396a1 和?csn-miR396a2共同調控，切割位點在目標基因的第11-12個核苷酸處；兩個基因comp159882和comp157894同時被miRNA167a調控，且有共同的切割位點，在目標基因的第11-12個核苷酸處；另外，miRNA394a調控comp156493，切割位點有兩處，分別為第10-11，17-18個核苷酸處；同樣的，novel-miR2調控comp145093，切割位點也有兩處，分別為第10-11，12-13個核苷酸處。5’-RLM-RACE的實驗驗證了這些降解組分析的結果，另外一些切割位點有待進一步的驗證。
7.茶葉中miRNA的表達模式分析
對茶樹1005葉片兒茶素含量的研究發現，兒茶素在不同葉片中的的含量由高到低排序為：第一葉，芽，第二葉，第三葉，成熟葉。第一葉，第三葉和成熟葉的兒茶素含量有顯著差異。
為了探索茶葉中miRNAs與兒茶素合成相關性，研究人員采用qRT-PCR的方法分析第一葉、第三葉以及成熟葉中miRNA（read values高于平均值）表達。通過表達模式的成簇分析將這些miRNA分成三組。第一組，miRNA表達模式與兒茶素含量成正相關，分別有novel-miR10, novel-miR13, novel-miR19, csn-miR165a, csn-miR170, csn-miR2593e 和novel-miR12；第二組，miRNA表達模式與兒茶素含量成負相關，分別有novel-miR1, novel-miR2, csn-miR160a, csn-miR162a, csn-miR394 和csn-miR396a；第三組，miRNA表達模式與兒茶素含量沒有顯著相關性，有csn-miR4380a。
8.調控兒茶素生物合成基因miRNA的鑒定
為了深入了解miRNA在調控兒茶素合成代謝中的功能，研究人員將高通量測序獲得的miRNA跟NCBI數據庫以及RNA測序的兒茶素生物合成相關基因的mRNA進行BLAST，預測可能的miRNA。為了消除假陽性，對預測的斷裂位點進行實驗驗證。通過5’-RLM-RACE實驗驗證了6個可能參與兒茶素生物合成功能基因表達調控的miRNA。它們分別是csn-miRNA167a、f csn-miR2593e、csn-miR4380a 、csn-miR3444b 、csn-miR5251 和csn-miR7777-5p.1。
9.兒茶素生物合成路徑基因和miRNAs表達分析
為了更好的了解兒茶素生物合成過程中miRNA與目標基因之間的表達模式以及相互作用，研究人員將不同葉片中兒茶素生物合成相關基因和miRNA表達量進行分析，并且與兒茶素含量變化的模式相比較。結果顯示，ANR和C4H有相似的表達模式，ANR在第三葉中表達量最高，它與EC，EGC和兒茶素含量沒有明顯的關系，在綠茶Shuchazao中有過類似的報道。CHI和DFR的表達量與兒茶素的含量成正相關的趨勢，這與之前的報道一致。經分析發現，大多數的miRNA表達模式與目標基因呈相反的趨勢?？傊?，miRNA和目標mRNA之間的表達模式和斷裂位點的負相關性是兒茶素生物合成中目標miRNA靶向調控mRNA的有力證據。
結論
該研究共鑒定了69個保守的miRNAs和47個新的miRNA。再結合降解組測序的和生物信息分析的方法預測了受19個miRNA調控的16個基因切割位點。通過5’-RLM-RACE實驗對其中5個有注釋的miRNA切割位點進行了驗證。qRT-PCR結果顯示：novel-miR1, novel-miR2,csn-miR160a, csn-miR162a, csn-miR394 和 csn-miR396a與兒茶素含量負相關。6個miRNA（csn-miRNA167a，csn-miR2593e，csn-miR4380a，csn-miR3444b，csn-miR5251和csn-miR7777-5p.1）及其與兒茶素生物合成相關的靶基因的表達也通過qRT-PCR進行了分析；這些miRNA和兒茶素含量之間呈正相關和負相關，而在其目標基因和兒茶素含量之間呈正相關。這個結果表明這些miRNA可能通過下調它們來負調節兒茶素生物合成生物合成相關靶基因。綜上所述，miRNA是茶葉中關鍵的調節因子，5′-RLM-RACE和表達分析的結果揭示了miRNAs在兒茶素合成代謝中的重要作用。
創新點
本研究采用多種生物技術手段的聯合分析（高通量測序，降解組測序，qRT-PCR技術和5’-RLM-RACE技術），尋找到新的調節兒茶素生物合成的miRNA，并且驗證了miRNA調控的切割位點。