05月28 定位+實驗驗證：Plant Journal | BSA助力黃瓜耐水淹定位解析
Bulked Segregant Analysis（BSA）分析是利用極端性狀個體混池快速進行功能基因挖掘的常用方法，廣泛應用在植物基因克隆方面。由百邁客和揚州大學陳學好教授課題組合作，利用SLAF-BSA策略定位黃瓜耐淹基因，相關研究成果發表于Plant Journal。
英文標題：The major-effect QTL CsARN6.1 encodes an AAA-ATPase domain-containing protein that is associated with waterlogging stress tolerance through promoting adventitious root formation
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中文標題：CsARN6.1編碼的AAA-ATPase基因通過促進不定根形成增強黃瓜耐水淹性
發表期刊：the Plant Journal， 2018
影響因子：5.90
實驗過程
1.不定根數目是數量性狀且與水淹脅迫耐受力顯著相關
表型觀察發現，水淹處理7天后，Zaoer-N幼苗下胚軸生長出許多不定根，而Pepino幾乎沒有；通過對F2群體表型統計，所有子代的不定根數目表現出正態分布，這也說明了該性狀為數量性狀。另外，對F2群體的949個個體進行水淹耐受力評估打分，發現不定根數目與水淹耐受力之間呈顯著正相關，皮爾森相關系數為0.72（P = 0.05），這表明不定根數目可以作為衡量水淹耐受力的可靠指標。
2、ARN6.1的初定位
利用SLAF-seq的方法對親本及兩個極端混池進行測序，親本測序深度分別為29.18×和22.85×，兩個混池的深度分別為50.6×和53.72×，以9930為參考基因組，利用△SNP-index和ED的方法計算顯著關聯位點，將關聯區域定位在6號染色體標記SLAF_marker_192310和SLAF_marker_192096之間，區間大小301kb（圖1）。
3、ARN6.1的精細定位
利用定位區間側翼SLAF標記（SLAF_marker_192310和SLAF_marker_192096）上的SNP，分別各開發KASP標記（KASP1和KASP13），并對2274個F2子代進行分析，結合基因分型和表型數據，將ARN6.1定位到61.5kb的區間（KASP10和KASP11）。為進一步縮小區間，利用KASP10和KASP11對4417個F2個體進行分型，得到6個重組個體，這6個重組個體分別自交得到6個F2:3家系，然后利用新開發的5個dCAPS對F2:3家系進行分型，結合所有表型數據，最終將ARN6.1定位在36.1kb的范圍內。對該區進行注釋，共有7個基因，有趣的是，其中5個基因都被預測為編碼AAA 型的ATP酶家族蛋白。
2個親本重測序分析，在36.1kb的區間內開發到25個SNP，研究者對100個黃瓜自交系的23個SNP（2個SNP只存在于Zaoer-N中而被過濾掉）進行分型，結合每個自交系不定根數目的表型數據進行局部關聯分析，結果顯示SNP02與表型有較強的關聯性。對SNP02分析發現，其位于Csa6G504460的第二外顯子，可能就是引起變異的SNP位點。
4、表達分析驗證Csa6G504460
前期研究中，研究者對親本Zaoer-N和Pepino幼苗下胚軸在水淹處理后進行轉錄組分析，以上定位區間內的7個基因只有Csa6G504460在處理組和對照組間存在差異表達，并且差異表達只發生在Zaoer-N中。而后，研究者對這7個基因又進行qRT-PCR分析，同樣發現只有Csa6G504460在Zaoer-N的處理組和對照組間存在差異表達，并且在處理后36h表達量差異出現峰值。另外，組織特異表達分析表明Csa6G504460在多個組織中均有表達，但是在根中的表達量顯著高于其他組織。因此，從基因表達角度驗證了Csa6G504460（以下命名為CsARN6.1）的真實性。
5、CsARN6.1突變體降低ATP酶活性
基因組和cDNA序列分析顯示，CsARN6.1擁有2個外顯子，被預測為編碼含有511個氨基酸殘基的AAA-ATPase結構域蛋白，該蛋白中含有一個coiled-coil結構域（圖2），前期關聯到的SNP02即位于該結構域，由于該SNP的突變導致Asp被替換成Gly，Zaoer-N為CsARN6.1^Asp型，表現出較強的ATP酶活性，而Pepino為CsARN6.1^Gly型，幾乎沒有ATP活性。
6、轉基因驗證
為驗證CsARN6.1的功能，將CsARN6.1^Asp通過PCR實驗克隆后，轉入擬南芥中，發現轉基因植株的根長顯著長于對照，同時，轉基因植株上可以明顯觀察到側根發育，而對照組則沒有側根發育。為進一步驗證，研究者將CsARN6.1^Asp轉入黃瓜品種Xintaimici（CsARN6.1^Gly型），并經多代自交和篩選，獲得單拷貝的純合轉基因植株。發芽后3天，轉基因植株的初生根長度顯著長于野生型。水淹處理后，轉基因黃瓜下胚軸中CsARN6.1的表達量顯著高于野生型。處理后7天，轉基因黃瓜下胚軸的不定根數目明顯高于野生型。另外，野生型黃瓜葉片和子葉的萎黃病較轉基因黃瓜嚴重。以上轉基因結果證實CsARN6.1能夠促進不定根形成和黃瓜水淹耐受力。
7、ATP酶活性影響黃瓜不定根形成
前期研究發現，EDTA能夠抑制AAA-ATPase蛋白的ATP酶活性。研究者通過體外實驗發現，經EDTA處理的CsARN6.1^Asp蛋白的ATP酶活性相對于對照降低24%（圖3 a）。隨后，研究者用加入EDTA的水處Zaoer-N幼苗，以檢測ATP酶活性損耗對下胚軸不定根的影響。結果發現，經EDTA處理后，Zaoer-N沒有了不定根生成能力（圖3 b.c）。
進化樹分析顯示，CsARN6.1與擬南芥At2G18190和At3G50930存在較高的同源性（圖3d），而在之前研究中發現，H2O2處理擬南芥后，At2G18190.1和At3G50930.1被顯著誘導表達。水淹后植物體內H2O2積累是普遍的生理響應。因而研究者嘗試在水中加入H2O2后處理Zaoer-N幼苗，與無水處理的對照相比，48h后處理組植株CsARN6.1的表達量是對照組的4.3倍，與不加H2O2的水處理的對照相比，48h后CsARN6.1的表達量是對照組的2.1倍（圖3e）。5天后統計不同處理的材料下胚軸不定根數目，發現與不加H2O2的水處理的對照相比，水中加入H2O2的處理組的不定根數目增加60%（圖3 f.g）。
總結
在該研究中，基因挖掘和功能分析使用了SLAF-seq、BSA分析、重測序、KASP、RNA-seq、qRT-PCR、PCR克隆等測序和分子實驗方法 成功分離適應水淹的主效基因CsARN6.1，并驗證基因功能，解析了黃瓜耐水淹分子機制。
百邁客云BSA分析工具是一款結合多年BSA分析項目分析經驗開發的包含一鍵式標準化分析和個性化多樣性分析集成式分析平臺．可以進行基本分析和個性化分析，基本分析內容包括：1) 原始數據導入；2) 與參考基因組比對；3) BSA分析；4) 一鍵式生成網頁版結題報告。
工具地址：
https://international.biocloud.net/zh/software/agriculture/detail/6388C5BF964943B7B4B1DDF4811A1BD2
BSA分析，即集群分離分析，它是通過具有相對性狀的一對親本雜交，在其任一分離后代群體中，根據個體表型（或基因型）的極端差異，選取一定量個體，將其DNA，RNA,SLAF-seq(百邁客自主研發的技術)混合，構建兩個基因池（pool）.然后將混池測序數據與參考基因組的序列比對，基于檢測到SNP,InDel等變異類型，尋找兩混池間存在顯著差異標記，利用歐氏距離，SNP-index等算法評估與性狀關聯的區域．并對區域內的基因進行功能注釋和富集分析等等．在基礎上還可以進行深入挖掘，如：引物設計，區域內基因挖掘及標記篩選等等！
本文系“百邁客生物”發布，轉載請聯系作者。